松材线虫常规分离方法介绍

我们知道松材线虫病是由松材线虫引起的具有毁灭性的森林病害，属我国重大外来入侵种，已被我国列入对内、对外的森林植物检疫对象。当监测普查发现松树枯死、松针变色等异常情况，需取样鉴定是否发生松材线虫病。鉴定时除了采用木屑法检测的分子检测设备不需先分离松材线虫，其他鉴定方法通常需要先分离松材线虫，正确的分离方法是及时发现松材线虫病疫情的重要环节之一。

对于松材线虫的分离，根据GB/T 23476——2009 《松材线虫病检疫技术规程》标准规定，一般采取贝尔曼漏斗法、浅盘法分离法、改进型线虫分离器分离。这些分离方法的原理是：线虫喜水，遇水便会从植物体或媒介昆虫体内游出。线虫个体小，可穿过纱布、筛网上的小孔，同时由于线虫身体比重比水大，所以线虫会下沉到浸泡样品的液体底部。下面我们分别介绍这几种分离方法。

1、贝尔曼漏斗法

这种方法是1917年由贝尔曼（Baermann）提出，这是寄生虫学家在家养哺乳动物的粪便中获得寄生线虫的方法上发展而来，简便实用，在检疫检验和疫情监测实践中被广泛应用。

贝尔曼漏斗法分离线虫装置图

贝尔曼漏斗法的操作方法：

(1) 在直径10~15 cm的漏斗末端接一段长约10 cm的乳胶管后置于漏斗架上，在乳胶管上装一止水夹；

(2) 在漏斗上铺大小适当的两层纱布；分离木屑时，两层纱布之间放1张纸巾。

(3) 将待检松材去皮后劈成长约3 ~4 cm，直径2~3 mm的细条，约取10 g置于漏斗中的纱布上，将纱布四角向中间盖上分离材料，再往漏斗注满清水；

(4) 由于趋水性和重力作用，线虫渐渐游离出松木进入水中，最后都沉降到漏斗末端的乳胶管中；

(5) 一般经12 h后镜检。轻轻打开止水夹，用培养皿接取少量分离液在解剖镜或显微镜下观察。或用5 mL离心管接取分离液，自然沉淀30 min或1500 r/min离心2 min，收集线虫供下一步检测。

2、浅盘法

浅盘法分离装置包括两个盘子，可由铝合金、不锈钢、塑料等材料制成。上面盘子底部是筛网，比下面的盘子稍小、稍浅。分离线虫时，在筛网上放两层纱布，再将木屑或劈好的小木条放上面。下面的盘子加水，筛网盘放入水中，水要没过样品。在20~30 ℃条件下放置12~24 h，将下面盘子的水收集到烧杯中，通过沉淀或离心收集线虫，供进一步检测。

贝尔曼浅盘法分离线虫装置图

3、改进型线虫分离器法

改进型线虫分离器分离线虫，兼顾漏斗法和浅盘法各自的优点。分离器由一只网筛、乳胶管、止水夹和一次压模成型的主体构成。在筛网上放两层纱布，再将木屑或劈好的小木条放上面。从网筛外缘加水至样品水平的位置。在20~30 ℃下放置12 h后，打开止水夹，用离心管接取分离液，通过沉淀或离心收集线虫，供进一步检测。

改进型漏斗分离松材线虫装置示意图

改进型线虫分离器近些年经过发展优化，出现了一些设计精巧便捷高效的新型线虫分离器，但普遍仍是基于贝尔曼漏斗法原理进行松材线虫分离，在实际应用中需要等待较长时间，给相关检疫工作带来了不便，为此生兴开发了最新型松材线虫快速分离器，解决松材线虫快速分离的难题。应用这款松材线虫快速分离器，样品准备好后，通电1分钟即可分离出线虫，与传统的贝尔曼漏斗法一般需12 h以上相比，大大地缩短了线虫的分离时间，提高了检疫效率。

新型松材线虫快速分离器

参考资料：

• 松材线虫病防治技术方案(2021年版)

• GB/T 23476——2009 松材线虫病检疫技术规程