拿到样品后如何分离出线虫？这里有几种松材线虫分离方法的详细操作步骤

松材线虫分离是检疫中较为常见的方法，如何快速分离松材线虫对提高检疫效率具有重要意义，今天小编为你整理了目前常用的松材线虫分离方法，下面就跟随小编一起来学习一下吧。

松材线虫传统分离方法

1、贝尔曼漏斗分离法

（1）置备一只直径10-15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长约15㎝的乳胶管，置于漏斗架上，在乳胶管上装一个止水夹。

（2）对媒介昆虫进行线虫分离时，可用剪刀将其剪碎或用尖头镊子、解剖针将其撕碎，剪取大小合适的2层纱布将碎体包裹，木质样品则剪成长3cm直径5mm左右的木条，将样品放入漏斗中，关闭漏斗下端乳胶管上的止水夹，然后从漏斗壁慢慢注入清水，使清水充满漏斗和下面乳胶管，水要漫过纱布包。

（3）浸泡24小时后，将培养皿置于乳胶管下，打开止水夹，接取15ml浸泡液，供镜检或作为样品送检[1]。

2、浅盘法

（1）分离装置由2个口径不同不锈钢或铝合金等材料制成的浅盘组成，里面口径略小，底部为粗网筛的浅盘放在另一个浅盘上面。

（2）将大小合适的2层纱布平铺于筛盘上，松木样品细木条（或木片、木屑）置于筛盘纱布上面，慢慢注入清水，使清水浸泡全部样品。

（3）浸泡24小时后，移去筛盘，把大浅盘内的样品浸泡液倒入烧杯中，烧杯内浸泡液中的线虫可通过自然沉降或离心方法，移去多余的水分，浓缩至适宜的量，以便显微镜检验[2]。

松材线虫快速分离方法

1分钟快速分离松材线虫

技术原理

通过负压产生水流，水流通过检材内部微管，将微管内的线虫带出，从而获得线虫液样本[3]。

快速分离设备：松材线虫1分钟快速分离器‍

快速分离流程

检材预处理

① 取得无松脂残留且断面平整的圆盘，直径5.0～20.0cm，厚度10cm左右为宜。

② 利用专用粘合胶将吸附罩与待检木材胶合。

③ 待胶水干后，将检材浸泡于水中。

线虫分离

① 将预处理好的检材浸泡在清水中（水面略低于检材的上沿）。

② 打开电源开关，此时吸附罩内有水渗入，达到待检量时，关闭电源开关。

③ 将吸附罩内的溶液倒入试管或烧杯中。

④ 吸取底部带有沉淀的分离液少许，进行检验。

以上就是松材线虫常见的分离方法，你学会了吗？通过以上方法获得的分离液即可进行下一步的镜检和分子鉴定。

DNA检测的金标准

实时荧光定量PCR技术

2009年南京林业大学和南京生兴防治联合研发的松材线虫自动化分子检测鉴定技术，实现松材线虫病分子检测技术在我国各省市县的推广和普及化，依靠该检测技术，结合形态学方法，基本解决了我国松材线虫病检疫和监测过程中的鉴定技术难题。

在该技术研究中，南京林业大学陈凤毛教授等以松材线虫的rDNA内部转录区为靶标，设计了一对实时荧光定量PCR引物和特异探针，构建了松材线虫实时荧光定量PCR检测方法。特异引物组合F11/Ｒ11与探针TaqMan－11能够较好地区分来自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属Seinura线虫。在10μL的反应体系中，能够检测出0.005pg的物种DNA含量。实时荧光定量PCR技术凭借其高灵敏度、高准确性和快速性等优点，已成为松材线虫分子检测鉴定主流方法，堪称DNA检测的金标准。

参考文献

[1] 冯士明. 简介松材线虫的分离方法 [J]. 云南林业, 2005, (02): 29.

[2] 王晨,宋绍禕,俞禄珍,等. 粒线虫分离方法的比较 [J]. 植物检疫, 2019, 33 (03): 29-32.

[3] 鲍友山,柴寅初,徐一芳. 松材线虫快速分离器[P]. 江苏省: CN307678827S, 2022-11-22.